Ένα πρωινό Κυριακής, τον Οκτώβριο του 2019, ο επικεφαλής της μονάδας οικολογίας ιών στα Εργαστήρια Rocky Mountain των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (NIH) έστειλε email σε έναν μεταδιδακτορικό ερευνητή του εργαστηρίου του, προτείνοντάς του μια ιδέα.
Από τον Lewis Kamb/U.S. Right to Know/The Defender
Ο Vincent Munster και ο μεταδιδακτορικός συνεργάτης του, Michael Letko, είχαν αφιερώσει εκείνη τη χρονιά στη δημιουργία ενός συστήματος για την ταχεία εξέταση του κατά πόσον δεκάδες κορωνοϊοί νυχτερίδων —συγγενικοί με τον SARS— θα μπορούσαν να μολύνουν ανθρώπινα κύτταρα.
Εκείνη την εβδομάδα, ο Munster διάβασε μια νέα προδημοσίευση από τις ερευνητικές ομάδες των διακεκριμένων ιολόγων Vineet Menachery και Ralph Baric, η οποία έδειχνε ότι η πρωτεάση θρυψίνη θα μπορούσε να διευκολύνει την είσοδο ορισμένων κορωνοϊών, οι οποίοι υπό άλλες συνθήκες δεν θα μπορούσαν να μολύνουν ανθρώπινα κύτταρα.
Ο Michael Letko τού είχε προωθήσει τη μελέτη δύο ημέρες νωρίτερα, με το σχόλιο: «Φαίνεται πως κι άλλες ομάδες θα καταλήξουν σύντομα σε αυτή την ιδέα».
«Θα μπορούσες να δημιουργήσεις μια πρωτεΐνη S με ένα ευρύτερο μοτίβο αποκοπής (όπως αυτό που αναγνωρίζεται από τη φουρίνη), ώστε να ενισχυθεί η μολυσματικότητα», απάντησε ο Munster στις 6 Οκτωβρίου 2019. «Μπορείς να συμπεριλάβεις ένα μοτίβο όπως το R-X-[K/R]-R↓. Θα είχε ενδιαφέρον να συνθέσουμε μερικά τέτοια».
Στην ορολογία της ιολογίας, ως «S» συμβολίζεται η πρωτεΐνη-ακίδα του κορωνοϊού, η οποία επιτρέπει στον ιό να προσδένεται στα κύτταρα που μολύνει, ενώ το R-X-[K/R]-R αποτελεί ένα μοτίβο θέσης αποκοπής από τη φουρίνη (ή θέση σχάσης από φουρίνη), ένα χαρακτηριστικό που μπορεί να καταστήσει τους ιούς ικανότερους να μολύνουν κύτταρα και να εξαπλώνονται.
Ο Munster πρότεινε στον συνεργάτη του να ενσωματώσει, μέσω γενετικής τροποποίησης, μια θέση φουρίνης στην πρωτεΐνη-ακίδα ενός κορωνοϊού, καθιστώντας τον έτσι πιο μολυσματικό.
Έντεκα εβδομάδες αργότερα, ένας κορωνοϊός που έφερε μια παρόμοια θέση αποκοπής από τη φουρίνη εμφανίστηκε στη Wuhan της Κίνας, πυροδοτώντας την πανδημία COVID-19. Πρόκειται για τον μοναδικό γνωστό «σαρμπεκοϊό» («sarbecovirus»), την ομάδα των συγγενικών με τον SARS κορωνοϊών που εξέταζαν τότε ο Munster και ο Letko, η οποία διαθέτει ένα τέτοιο χαρακτηριστικό.
Η συγκεκριμένη αλληλογραφία μέσω email δεν είχε δημοσιοποιηθεί ποτέ στο παρελθόν. Περιλαμβάνεται σε μια δέσμη εγγράφων 270 σελίδων, την οποία έδωσαν πρόσφατα στη δημοσιότητα τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) προς την οργάνωση «U.S. Right to Know», κατόπιν αιτήματος που υποβλήθηκε βάσει του Νόμου περί Ελευθερίας της Πληροφόρησης. Το αίτημα αφορούσε συγκεκριμένη αλληλογραφία από το εργαστήριο του Munster στο Hamilton της Montana, για το διάστημα από τον Μάρτιο του 2019 έως τις 22 Ιανουαρίου 2020, ημερομηνία κατά την οποία η ομάδα του δημοσίευσε μία από τις πρώτες μελέτες που έδειχναν ότι ο νέος κορωνοϊός χρησιμοποιούσε έναν υποδοχέα των ανθρώπινων κυττάρων, τον ACE2, ως πύλη εισόδου στα κύτταρα.
Δύο νέα στοιχεία προκύπτουν από τα αρχεία: Εβδομάδες πριν από την έναρξη της πανδημίας, ένας υψηλόβαθμος ιολόγος των NIH (Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας των ΗΠΑ) πρότεινε γραπτώς να ενσωματωθεί σε μια πρωτεΐνη-ακίδα, παρόμοια με εκείνη του SARS, ένα χαρακτηριστικό που έμελλε να αποτελέσει το βασικό επιχείρημα υπέρ της εργαστηριακής προέλευσης της COVID-19: μια θέση διάσπασης από φουρίνη (furin cleavage site).
Επιπλέον, καθ’ όλη τη διάρκεια του ίδιου έτους, το εργαστήριό του ζητούσε από ερευνητές που εντόπιζαν ιούς αδημοσίευτες αλληλουχίες της πρωτεΐνης-ακίδας κορωνοϊών από νυχτερίδες —και τις λάμβανε. Μεταξύ αυτών που παρείχαν τα δεδομένα ήταν ερευνητές της κοινοπραξίας PREDICT, η οποία χρηματοδοτείται από τις ΗΠΑ, της οποίας ο κύριος εταίρος με έδρα τη Νέα Υόρκη, η EcoHealth Alliance, διατηρούσε μακροχρόνια συνεργασία με το Ινστιτούτο Ιολογίας της Wuhan (WIV) για τη συλλογή και τη μελέτη ιών που σχετίζονται με τον SARS.
Το καθένα από αυτά τα δεδομένα αφορά ένα διαφορετικό, καίριο σημείο στη συζήτηση για την προέλευση του ιού.
Rocky Mountain Labs
Η θέση διάσπασης από φουρίνη αποτελεί το συγκεκριμένο γενετικό χαρακτηριστικό που επικαλείται συχνότερα όποιος υποστηρίζει ότι ο SARS-CoV-2 δεν προέκυψε αποκλειστικά στη φύση.
Το δεύτερο στοιχείο αφορά τις αδημοσίευτες αλληλουχίες: δεδομένου ότι ο ιός της πανδημίας δεν παρουσιάζει ομοιότητες με τίποτα από όσα έχουν καταγραφεί στην επιστημονική βιβλιογραφία, τα περισσότερα σενάρια περί εργαστηριακής προέλευσης βασίζονται στην υπόθεση ότι κάποιο εργαστήριο κατείχε έναν ιό που ο υπόλοιπος κόσμος δεν είχε δει ποτέ.
Ωστόσο, τίποτα στα αρχεία δεν δείχνει ότι ο Letko υλοποίησε την πρόταση του Munster για την εισαγωγή μιας θέσης διάσπασης από φουρίνη (furin cleavage site) σε μια πρωτεΐνη ακίδας (spike protein) του ιού SARS. Μάλιστα, η θέση διάσπασης από φουρίνη που εντοπίζεται στον SARS-CoV-2 διαφέρει από το μοτίβο, δηλαδή τη σύντομη αλληλουχία αμινοξέων, που είχε προτείνει ο Munster.
Επιπλέον, από τα έγγραφα δεν προκύπτει ότι τα Rocky Mountain Labs διέθεταν τον SARS-CoV-2 ή κάποιον στενό συγγενή του, ούτε ότι ο Munster ή ο Letko επικοινώνησαν απευθείας με ερευνητές στη Wuhan κατά τη διάρκεια της εργασίας τους στο συγκεκριμένο πρότζεκτ.
Η έρευνά τους βασίστηκε επίσης σε συνθετικά τμήματα γονιδίων και όχι σε ζωντανούς ιούς, χρησιμοποιώντας σωματίδια που δεν έχουν τη δυνατότητα αναπαραγωγής ή εξάπλωσης. Τέτοιου είδους εργασίες ενέχουν, γενικά, μικρότερους κινδύνους βιοασφάλειας.
Οι δύο αλληλουχίες πρωτεϊνών ακίδας από ιούς νυχτερίδων, οι οποίες δεν είχαν δημοσιευθεί προηγουμένως και ελήφθησαν μέσω του προγράμματος PREDICT (μία από τη Μαλαισία και μία από την Ουγκάντα και τη Ρουάντα), παρουσιάζουν τόσο μεγάλη γενετική απόσταση από τον SARS-CoV-2, ώστε να αποκλείεται το ενδεχόμενο να αποτέλεσαν τη βάση για την εμφάνισή του.
Ο Letko, ο οποίος είναι πλέον αναπληρωτής καθηγητής στο Πολιτειακό Πανεπιστήμιο της Ουάσιγκτον (Washington State University), αρνήθηκε να σχολιάσει το θέμα, δηλώνοντας σε μήνυμα ηλεκτρονικού ταχυδρομείου: «Θα γράψετε ό,τι θέλετε να γράψετε, ανεξάρτητα από την αλήθεια ή από το τι έχω εγώ να πω».
Ο Munster δεν ανταποκρίθηκε στα αιτήματα για σχολιασμό. Νωρίτερα φέτος, του ασκήθηκε δίωξη επειδή εισήγαγε στις ΗΠΑ δείγματα του ιού της ευλογιάς των πιθήκων (mpox) χωρίς τα απαραίτητα συνοδευτικά έγγραφα, καθώς και επειδή προέβη σε ψευδείς δηλώσεις προς τις αρχές επιβολής του νόμου, στο πλαίσιο μιας άλλης, άσχετης έρευνας των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (NIH). Ο ίδιος δήλωσε αθώος.
Το γραφείο τύπου των NIH αρνήθηκε επίσης να απαντήσει σε ερωτήματα σχετικά με το γιατί ο οργανισμός δεν είχε ενημερώσει προηγουμένως το κοινό ότι οι επιστήμονές του είχαν ζητήσει και αποκτήσει —πριν από την πανδημία— μη δημοσιευμένες αλληλουχίες πρωτεϊνών ακίδας από κορωνοϊούς παρόμοιους με τον SARS, ή ότι είχαν προτείνει την εισαγωγή μιας θέσης διάσπασης από φουρίνη σε μια τέτοια πρωτεΐνη ακίδας.
Συγκλίνουσες προσεγγίσεις
Η πρόταση του Munster για την προσθήκη μιας θέσης διάσπασης από φουρίνη (furin cleavage site) αποτελεί τη δεύτερη γνωστή περίπτωση κατά την οποία επιστήμονες πρότειναν την εισαγωγή αυτού του χαρακτηριστικού γνωρίσματος σε μια πρωτεΐνη ακίδας ιού τύπου SARS, περίπου δύο χρόνια πριν από την εμφάνιση της COVID-19.
Το 2018, η οργάνωση EcoHealth Alliance, το εργαστήριο του Baric και ερευνητές του Ινστιτούτου Ιολογίας της Wuhan (WIV) είχαν προτείνει την ίδια τροποποίηση στην Υπηρεσία Προηγμένων Ερευνητικών Προγραμμάτων Άμυνας (DARPA) των ΗΠΑ, στο πλαίσιο μιας εργασίας που θα χρησιμοποιούσε ζωντανούς, αναπαραγόμενους ιούς. Η αίτησή τους, γνωστή ως πρόταση DEFUSE, απορρίφθηκε.
Η συγκεκριμένη ιδέα παρουσιάζει ιδιαίτερο ενδιαφέρον, καθώς η θέση διάσπασης από φουρίνη, η οποία συνέβαλε στην ικανότητα του ιού να προκαλέσει την πανδημία, βρίσκεται στο επίκεντρο της συζήτησης σχετικά με την προέλευση της πανδημίας.
Ορισμένοι υποστηρικτές της θεωρίας περί εργαστηριακής προέλευσης βλέπουν την πρόταση DEFUSE ως ένα είδος «σχεδίου» για τη δημιουργία του SARS-CoV-2.
Αντιθέτως, εξέχοντες υποστηρικτές της θεωρίας περί φυσικής προέλευσης υποστηρίζουν ότι η σκόπιμη κατασκευή ενός τέτοιου χαρακτηριστικού θα ήταν απίθανη, καθώς και περιττά περίπλοκη.
Το μήνυμα ηλεκτρονικού ταχυδρομείου του Munster παρέχει στους υποστηρικτές της εργαστηριακής προέλευσης ένα ακόμη παράδειγμα πρότασης για την εισαγωγή μιας τέτοιας θέσης φουρίνης.
Η αποκάλυψη ότι το εργαστήριο του Munster αναζητούσε αδημοσίευτες αλληλουχίες αναδεικνύει μια άλλη πτυχή της συζήτησης για την προέλευση της COVID-19.
Δεδομένου ότι ο SARS-CoV-2 δεν προέρχεται από κανέναν ιό που να έχει περιγραφεί προηγουμένως στην επιστημονική βιβλιογραφία, οποιοδήποτε σενάριο κατά το οποίο ο ιός αυτός κατασκευάστηκε τεχνητά προϋποθέτει ότι κάποιο εργαστήριο διέθετε αλληλουχίες σχετικές με τον SARS, οι οποίες δεν είχαν ποτέ δημοσιοποιηθεί.
Σε μια ανασκόπηση του 2021 για τον SARS-CoV-2, που δημοσιεύθηκε στο περιοδικό «Cell» από 21 επιστήμονες, το εν λόγω σενάριο χαρακτηρίστηκε ως μη εύλογο. «Δεν υπάρχει κανένας λογικός πειραματικός λόγος για τον οποίο θα αναπτυσσόταν ένα νέο γενετικό σύστημα χρησιμοποιώντας έναν άγνωστο και αδημοσίευτο ιό», έγραψαν οι ερευνητές.
Ωστόσο, τα αρχεία δείχνουν ότι ένα εργαστήριο της αμερικανικής κυβέρνησης προέβαινε ακριβώς σε μια τέτοια ενέργεια, δύο χρόνια νωρίτερα.
Η πλατφόρμα του Letko αποτελούσε ένα νέο γενετικό σύστημα, και ο ίδιος αναζητούσε αδημοσίευτες αλληλουχίες ακριβώς επειδή δεν είχαν δημοσιευθεί. Η κοινοποίησή τους, όπως έγραψε τον Απρίλιο του 2019, «θα ενισχύσει σίγουρα τον αντίκτυπο της εργασίας μας, παρέχοντας μια απόδειξη της αρχής λειτουργίας μέσω αδημοσίευτων αλληλουχιών».
Ερευνητές στο πλαίσιο ενός προγράμματος εντοπισμού ιών, το οποίο χρηματοδοτείται από τις ΗΠΑ, παρείχαν δύο τέτοια δείγματα μέσα σε διάστημα οκτώ εβδομάδων. Ένας από τους ερευνητές, ο Simon Anthony, ήταν επίσης εκ των συντακτών της ανασκόπησης που δημοσιεύθηκε στο περιοδικό «Cell».
Η Alina Chan, μοριακή βιολόγος που έχει ταχθεί υπέρ μιας ενδελεχούς διερεύνησης των σεναρίων περί εργαστηριακής προέλευσης της Covid-19, εξέτασε πρόσφατα την αλληλογραφία μέσω ηλεκτρονικού ταχυδρομείου μεταξύ των Munster και Letko, κατόπιν αιτήματος της οργάνωσης U.S. Right To Know.
«Αυτό που προκύπτει είναι ότι διαφορετικές ομάδες ιολόγων συγκλίνουν στην ιδέα της εισαγωγής θέσεων διάσπασης στις πρωτεΐνες-ακίδες δυνητικά επικίνδυνων κορωνοϊών», δήλωσε η ίδια.
«Αν υποθέσουμε ότι η COVID-19 έχει εργαστηριακή προέλευση, τότε —ακόμη κι αν το εργαστήριο στη Wuhan δεν ήταν εκείνο που προκάλεσε την πανδημία— είναι πιθανό κάποιο εργαστήριο στις ΗΠΑ να ακολουθούσε, τελικά, την ίδια πορεία».
Michael Letko
Αναζήτηση αλληλουχιών
Η πρόταση που έστειλε ο Munster μέσω email δεν προέκυψε ξαφνικά. Ο ίδιος και ο Letko βρίσκονταν στη μέση ενός ερευνητικού έργου διάρκειας ενός έτους, το οποίο τεκμηριώνεται από την έναρξή του στα έγγραφα που δόθηκαν πρόσφατα στη δημοσιότητα.
Επτά μήνες νωρίτερα, τον Μάρτιο του 2019, ο Munster και ο Letko έθεσαν ως στόχο να απαντήσουν σε ένα ερώτημα: από τις εκατοντάδες κορωνοϊούς που σχετίζονται με τον SARS και περιλαμβάνονται σε ερευνητικές βάσεις δεδομένων ανά τον κόσμο, ποιοι θα μπορούσαν να μολύνουν τον άνθρωπο;
Ο Letko ανέπτυξε μια εναλλακτική μέθοδο, την οποία ο ίδιος και ο Munster περιέγραψαν ως «ταχεία και κλιμακούμενη πλατφόρμα», σύμφωνα με τα έγγραφα.
Αντί να κατασκευάσουν ολόκληρο τον κάθε ιό ξεχωριστά, απομόνωσαν μόνο τον τομέα δέσμευσης υποδοχέα (receptor-binding domain), το τμήμα της πρωτεΐνης ακίδας που προσδένεται στον υποδοχέα του κυττάρου-ξενιστή και τον ενσωμάτωσαν στον σκελετό της πρωτεΐνης ακίδας του ιού SARS-CoV.
Στη συνέχεια, τοποθέτησαν αυτές τις χιμαιρικές πρωτεΐνες ακίδας σε αβλαβή σωματίδια-φορείς και τα χρησιμοποίησαν για να μολύνουν κύτταρα που εξέφραζαν τον υποδοχέα hACE2, τον υποδοχέα που χρησιμοποιεί ο SARS-CoV για να εισέλθει στο ανθρώπινο αναπνευστικό σύστημα.
Η εκπομπή φωτός από το βιοφωταυγές ένζυμο λουσιφεράση υποδήλωνε ότι η είσοδος στο κύτταρο είχε επιτευχθεί. Χάρη στη μέθοδο του Letko, διαδικασίες που υπό κανονικές συνθήκες απαιτούσαν μήνες για να ολοκληρωθούν, πλέον διαρκούσαν περίπου τρεις εβδομάδες.
Το κρίσιμο στοιχείο που χρειαζόταν για τη δοκιμή της μεθόδου τους ήταν οι αλληλουχίες των πρωτεϊνών ακίδας.
Ο Letko είχε ήδη εξετάσει όλες τις δημοσιευμένες αλληλουχίες ιών που έμοιαζαν με τον SARS. Έτσι, όπως προκύπτει από τα έγγραφα, αυτός και ο Munster άρχισαν να αναζητούν άλλες, αδημοσίευτες αλληλουχίες.
Στις 8 Μαρτίου 2019, ο Munster έστειλε email στον Peter Daszak, πρόεδρο της EcoHealth Alliance, στον αντιπρόεδρο Kevin Olival και στον ιολόγο του Πανεπιστημίου Columbia, Simon Anthony, επισυνάπτοντας μια εμπιστευτική περίληψη που περιλάμβανε διαγράμματα και εικόνες σχετικά με το έργο τους.
«Παρόλο που έχουμε πλέον ελέγξει όλες τις παραλλαγές που έχουν δημοσιευτεί μέχρι σήμερα για τους βήτα-κορωνοϊούς της γενεαλογικής γραμμής Β (lineage B), ως προς την ικανότητά τους να εισέρχονται σε κύτταρα πρωτευόντων θηλαστικών, αναζητούμε επιπλέον, αδημοσίευτες αλληλουχίες βήτα-κορωνοϊών της ίδιας ομάδας, προκειμένου να τις δοκιμάσουμε στην πλατφόρμα μας», έγραψε ο Munster.
Ζήτησε από τους παραλήπτες να μην διανείμουν το συνημμένο αρχείο, καθώς η εργασία ήταν «ακόμη αδημοσίευτη και αφορούσε ένα πεδίο με έντονο ανταγωνισμό».
Από τους τρεις αποδέκτες, μόνο ο Anthony, ο οποίος τότε ήταν ένα από τα βασικά ηγετικά στελέχη του προγράμματος PREDICT, εμφανίζεται στην αλληλογραφία που δόθηκε στη δημοσιότητα. Απάντησε αργότερα εκείνο το βράδυ: «Γεια! Φαίνεται εξαιρετικό».
Simon Anthony
Όπως προκύπτει από τα μηνύματα ηλεκτρονικού ταχυδρομείου, ακολούθησαν διαπραγματεύσεις διάρκειας δύο μηνών.
Στις 5 Απριλίου, ο Letko ευχαρίστησε τον Anthony «που συμφώνησε να μοιραστεί μαζί μας τις αλληλουχίες της πρωτεΐνης ακίδας από ιούς της γενεαλογικής γραμμής Β των βητακοροναϊών», προσθέτοντας ότι το αδημοσίευτο υλικό «σίγουρα θα ενισχύσει τον αντίκτυπο της εργασίας μας».
Στις 2 Μαΐου, ο Anthony ενημέρωσε σχετικά, έπειτα από μια συνάντηση του PREDICT στο Βανκούβερ της Βρετανικής Κολομβίας. Η ομάδα του είχε εντοπίσει «περίπου 5 ή 6 νέους ιούς της ομάδας 2b», όπως έγραψε, αλλά μέχρι εκείνη τη στιγμή είχαν «καταφέρει να αποκτήσουν τις αλληλουχίες της πρωτεΐνης ακίδας μόνο για τους 2 από αυτούς».
Ο Anthony ανέφερε ότι, δεδομένου πως κανένας από τους ιούς δεν είχε δημοσιευθεί προηγουμένως, η εργασία του Letko «θα αποτελούσε την πρώτη αναφορά αυτών των ιών στη βιβλιογραφία», υπό την προϋπόθεση ότι ο Letko θα αναγνώριζε το PREDICT και τους συνεργάτες του ως συν-συγγραφείς.
Ο Letko συμφώνησε.
Δύο ημέρες αργότερα, ο Anthony απέστειλε τις αλληλουχίες. Τις ταυτοποίησε ως PREDICT_CoV-51 (απομόνωμα PDF-0663) από τη Μαλαισία, το οποίο ο Anthony χαρακτήρισε ως «ΕΞΑΙΡΕΤΙΚΑ αποκλίνον· μπορεί να παρουσιάζει μεγάλο ενδιαφέρον»— και PREDICT_CoV-43, από την Ουγκάντα και τη Ρουάντα.
«Εξαιρετικό!» απάντησε ο Munster. «Θα σας ενημερώσω για τα αποτελέσματα!»
Ο Anthony είχε, σε γενικές γραμμές, δίκιο. Ένα μικρό τμήμα του ιού από τη Μαλαισία είχε καταχωρηθεί το 2016 στη GenBank, τη δημόσια βάση δεδομένων αλληλουχιών των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας (NIH) των ΗΠΑ και είχε αναφερθεί το επόμενο έτος σε μια επισκόπηση που συνέγραψαν ο Anthony, ο Daszak και άλλοι. Ωστόσο, ούτε η πλήρης αλληλουχία της πρωτεΐνης ακίδας ούτε το ολοκληρωμένο γονιδίωμα του ιού ήταν διαθέσιμα στο κοινό.
Για τον ιό από την Αφρική, δεν υπήρχε απολύτως καμία δημόσια πληροφορία. Σε καμία από τις δύο περιπτώσεις, κανείς εκτός του PREDICT δεν θα μπορούσε να αποκτήσει την αλληλουχία της πρωτεΐνης ακίδας, το τμήμα εκείνο που καθορίζει αν ένας ιός μπορεί να εισέλθει σε ανθρώπινα κύτταρα και το μοναδικό τμήμα που μπορούσε να αξιοποιήσει η πλατφόρμα του Letko.
Ένα βήμα παραπέρα
Πέντε μήνες αργότερα, αφού διάβασε τη νέα προδημοσίευση σχετικά με την τρυψίνη, ο Munster πρότεινε να προχωρήσει το πρότζεκτ του Letko ένα βήμα παραπέρα.
Για να μολύνει ένας κορωνοϊός ένα κύτταρο-ξενιστή, η πρόσδεση στον υποδοχέα αποτελεί μόνο το πρώτο βήμα. Στη συνέχεια, η πρωτεΐνη-ακίδα πρέπει να υποστεί διάσπαση από κάποιο ένζυμο του ίδιου του ξενιστή, προτού ο ιός μπορέσει να συγχωνευθεί με το κύτταρο και να εισέλθει σε αυτό. Αυτά τα ένζυμα, τα οποία διασπούν τις πρωτεΐνες, ονομάζονται πρωτεάσες και το καθένα στοχεύει σε διαφορετικά σημεία.
Η πρωτεάση για την οποία είναι «σχεδιασμένη» μια πρωτεΐνη-ακίδα καθορίζει, σε μεγάλο βαθμό, ποιους ιστούς μπορεί να μολύνει ο ιός. Ο SARS-CoV εξαρτάται από πρωτεάσες που δεν είναι διαθέσιμες σε όλα τα σημεία του σώματος. Η φουρίνη (furin), ωστόσο, εκφράζεται στα κύτταρα των περισσότερων ιστών.
Η προδημοσίευση των Menachery και Baric, η οποία αποτέλεσε την αφορμή για την ιδέα του Munster, έδειξε ότι η εξωγενής προσθήκη τρυψίνης θα μπορούσε να επιτρέψει την είσοδο σε ανθρώπινα κύτταρα σε κορωνοϊούς που, υπό άλλες συνθήκες, δεν θα μπορούσαν να τα μολύνουν.
Η τρυψίνη είναι μια πολύ λιγότερο εκλεκτική πρωτεάση: διασπά μια πρωτεΐνη σε σημεία όπου εντοπίζονται κοινά αμινοξέα, αντί να απαιτεί μια συγκεκριμένη, μικρή αλληλουχία (μοτίβο). Αυτό που πρότεινε ο Munster στον Letko, η εισαγωγή, μέσω γενετικής τροποποίησης, μιας θέσης αναγνώρισης από τη φουρίνη στην ίδια την πρωτεΐνη-ακίδα, θα επέτρεπε στον ιό να προκαλεί ο ίδιος τη διάσπαση της πρωτεΐνης του.
Αντί να περιμένει κάποιο εξωγενές ένζυμο να επιτελέσει αυτή τη λειτουργία, η παρουσία μιας θέσης αναγνώρισης από τη φουρίνη θα μπορούσε να ξεπεράσει το εμπόδιο σε ένα μόνο βήμα, «ενισχύοντας τη μολυσματικότητα», όπως έγραψε ο Munster.
Η ιδέα αυτή είχε προταθεί και στο παρελθόν.
Peter Daszak, EcoHealth Alliance
Η οργάνωση EcoHealth Alliance υπέβαλε την πρόταση DEFUSE στην DARPA, στο πλαίσιο ενός προγράμματος με την ονομασία PREEMPT (PREventing EMerging Pathogenic Threats – Πρόληψη Αναδυόμενων Παθογόνων Απειλών). Στους βασικούς εταίρους περιλαμβάνονταν το εργαστήριο του Baric στο Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας (UNC) και η Zhengli Shi, κορυφαία ερευνήτρια κορωνοϊών στο εργαστήριο της Wuhan.
Η πρόταση αποσκοπούσε στην εισαγωγή θέσεων πρωτεολυτικής διάσπασης, συμπεριλαμβανομένων θέσεων αναγνώρισης φουρίνης, στις πρωτεΐνες-ακίδες κορωνοϊών που εντοπίζονται σε νυχτερίδες και σχετίζονται με τον SARS, με στόχο την αξιολόγηση και την ενίσχυση της ικανότητάς τους να μολύνουν ανθρώπινα κύτταρα. Η DARPA απέρριψε τη χρηματοδότηση της πρότασης, επισημαίνοντας τους κινδύνους που ενέχει η έρευνα τύπου «απόκτησης νέων λειτουργιών» (gain-of-function research).
Το όνομα του Munster δεν περιλαμβανόταν στην πρόταση που υποβλήθηκε στη DARPA. Ωστόσο, σύμφωνα με επίσημη αλληλογραφία του Κογκρέσου, δύο μήνες νωρίτερα αποτελούσε μέρος της ομάδας DEFUSE.
Τον Απρίλιο του 2024, ο Γερουσιαστής Rand Paul (Ρεπουμπλικανός από το Κεντάκι), ο οποίος τότε κατείχε τη θέση του ανώτερου μέλους της μειοψηφίας στην Επιτροπή Εσωτερικής Ασφάλειας και Κυβερνητικών Υποθέσεων της Γερουσίας, απέστειλε επιστολή στο Υπουργείο Υγείας και Ανθρωπίνων Υπηρεσιών των ΗΠΑ (HHS) και στη DARPA. Ανέφερε ότι περιήλθαν στην κατοχή του έγγραφα, σύμφωνα με τα οποία «ο Vincent Munster, από το Εργαστήριο Rocky Mountain του NIAID [Εθνικό Ινστιτούτο Αλλεργιών και Λοιμωδών Νοσημάτων], εμφανιζόταν ως εταίρος στην πρόταση DEFUSE, η οποία παρουσιάστηκε κατά τη διάρκεια της εκδήλωσης “PREEMPT Proposers Day”», μια εκδήλωση της DARPA τον Ιανουάριο του 2018, όπου ο Daszak παρουσίασε το πρότζεκτ σε εκπροσώπους τουλάχιστον 15 ομοσπονδιακών υπηρεσιών.
Όπως έγραψε ο Paul, το Εργαστήριο Rocky Mountain «αναφερόταν κάποια στιγμή ως εταίρος», μαζί με το Ινστιτούτο Ιολογίας της Wuhan (WIV), το Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας (UNC), το Εργαστήριο Lipkin του Πανεπιστημίου Κολούμπια και το Duke-NUS. Σύμφωνα με τον Paul, η αποκάλυψη αυτή φαίνεται να έρχεται σε αντίθεση με την κατάθεση που έδωσε στο Κογκρέσο ο πρώην διευθυντής του Εθνικού Ινστιτούτου Αλλεργιών και Λοιμωδών Νοσημάτων (NIAID), Anthony Fauci, ο οποίος είχε δηλώσει ότι τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) δεν γνώριζαν τίποτα για το DEFUSE.
Rand Paul
Μέχρι τη στιγμή που η πρόταση υποβλήθηκε στη DARPA, τον Μάρτιο εκείνου του έτους, ο Munster και το εργαστήριό του δεν περιλαμβάνονταν πλέον σε αυτήν. Η τελική λίστα των εταίρων περιελάμβανε την EcoHealth, το WIV, το UNC, το Duke-NUS, το Εθνικό Κέντρο Υγείας Άγριας Ζωής της USGS (Γεωλογική Υπηρεσία των ΗΠΑ) και το Ερευνητικό Κέντρο του Palo Alto.
Ο Paul ζήτησε από το HHS αρχεία που να αφορούν «όλες τις επικοινωνίες μεταξύ του Vincent Munster και οποιουδήποτε ατόμου από την EcoHealth Alliance, το WIV, το Πανεπιστήμιο της Βόρειας Καρολίνας, το Πανεπιστήμιο Κολούμπια ή το Duke-NUS». Ο Paul δεν έχει δημοσιοποιήσει τα έγγραφα στα οποία βασίστηκε, ενώ ούτε το HHS ούτε η DARPA έχουν απαντήσει δημόσια στα αιτήματά του.
Τα έγγραφα των NIH που δόθηκαν πρόσφατα στη δημοσιότητα δείχνουν ότι, περίπου ένα χρόνο μετά την υποβολή της πρότασης DEFUSE, ο Munster ζήτησε από την EcoHealth αδημοσίευτες αλληλουχίες ιών της ομάδας των σαρβεκοϊών (sarbecoviruses). Προκύπτει επίσης ότι έλαβε τις αλληλουχίες αυτές από έναν ιολόγο στο Κέντρο Λοιμώξεων και Ανοσίας του Πανεπιστημίου Κολούμπια, το κέντρο που διευθύνει ο Ian Lipkin και ότι, τον Οκτώβριο του 2019, πρότεινε τη δημιουργία μιας πρωτεΐνης ακίδας που θα διέθετε θέση διάσπασης τύπου φουρίνης (furin-like cleavage site), με σκοπό την ενίσχυση της μολυσματικότητας.
Ο Steven E. Massey, καθηγητής βιοπληροφορικής στο Πανεπιστήμιο του Πουέρτο Ρίκο και ερευνητής στην DRASTIC, την ανεξάρτητη ομάδα που δημοσίευσε πρώτη την πρόταση DEFUSE, χαρακτήρισε την πρόταση του Munster «σημαντική», αναφέροντας ότι «δείχνει πως η ιδέα [για τη θέση φουρίνης] κυκλοφορούσε εκτός της ομάδας EHA-WIV-UNC» – αναφορά στις EcoHealth Alliance, WIV και UNC.
Το email του Munster δεν αναφέρει το DEFUSE. Αντιθέτως, η ιδέα του εμφανίζεται ως αντίδραση στην προδημοσίευση των Menachery και Baric, παρουσιαζόμενη ως ένα πιθανό επόμενο πείραμα στο πλαίσιο της εργασίας του ίδιου και του Letko.
Επιπλέον, το μοτίβο που πρότεινε δεν είναι το ίδιο με αυτό που εντοπίστηκε στον ιό της πανδημίας, ο οποίος εμφανίστηκε λιγότερο από τρεις μήνες αργότερα. Στη θέση αυτή, ο SARS-CoV-2 φέρει αλανίνη, ενώ το μοτίβο του Munster προέβλεπε λυσίνη ή αργινίνη.
Μια υποβέλτιστη θέση
Αυτή η διαφορά είναι καθοριστική. Η θέση φουρίνης στον SARS-CoV-2 ενισχύει σημαντικά την ικανότητα του ιού να εισέρχεται στα κύτταρα του ανθρώπινου αναπνευστικού συστήματος και θεωρείται ευρέως ως βασικός παράγοντας που συμβάλλει στη μεταδοτικότητά του. Το γεγονός ότι απουσιάζει από κάθε άλλον σαρμπεκοϊό (sarbecovirus) που απαντάται στη φύση αποτελεί επίσης ένα από τα επιχειρήματα που επικαλούνται συχνότερα όσοι υποστηρίζουν τη θεωρία της εργαστηριακής προέλευσης.
Η ανασκόπηση του 2021 στο περιοδικό «Cell» εξέτασε επίσης άμεσα το ενδεχόμενο η εν λόγω θέση να αποτελεί προϊόν τεχνητής παρέμβασης.
Οι συγγραφείς της, μεταξύ των οποίων οι Kristian Andersen, Robert Garry και Simon, υποστήριξαν ότι η ίδια η αλληλουχία της θέσης συνηγορεί κατά της εκδοχής του εργαστηριακού σχεδιασμού.
Το μοτίβο του SARS-CoV-2, RRAR, «δεν ταυτίζεται με την τυπική του μορφή (R-X-R/K-R)», έγραψαν οι ερευνητές, και χαρακτηρίζεται ως «υποβέλτιστο» σε σύγκριση με τα αντίστοιχα μοτίβα άλλων ανθρώπινων κορωνοϊών.
«Δεν υπάρχει κανένας λογικός λόγος για τον οποίο ένας τεχνητά κατασκευασμένος ιός θα διέθετε μια τόσο υποβέλτιστη θέση διάσπασης από φουρίνη, καθώς κάτι τέτοιο θα απαιτούσε ένα τόσο ασυνήθιστο και περιττά περίπλοκο εγχείρημα γενετικής μηχανικής», ανέφερε η μελέτη.
Σημείωσαν, μάλιστα, ότι η μοναδική προγενέστερη εργασία στην οποία εισήχθη θέση φουρίνης στο συγκεκριμένο σημείο της πρωτεΐνης ακίδας του SARS-CoV, είχε χρησιμοποιήσει μια βέλτιστη αλληλουχία σε ένα σύστημα ψευδοτύπων.
Ο Massey αμφισβητεί αυτή την προσέγγιση.
Ανέφερε ότι η υπερβολικά αποτελεσματική διάσπαση μπορεί να αποσταθεροποιήσει την πρωτεΐνη ακίδα και να μειώσει την ικανότητα του ιού να εισέρχεται στα κύτταρα· επομένως, μια θέση που «στα χαρτιά» φαίνεται μη ιδανική, ενδέχεται να μην είναι τέτοια για τον ίδιο τον ιό.
Τα έγγραφα που δόθηκαν πρόσφατα στη δημοσιότητα δείχνουν ότι ο Munster ακολουθούσε συλλογιστική παρόμοια με εκείνη των συγγραφέων της δημοσίευσης στο περιοδικό «Cell», σχεδόν δύο χρόνια πριν από τη δημοσίευση της ανασκόπησής τους. Το μοτίβο που πρότεινε ο ίδιος ταυτίζεται με την τυπική μορφή που περιγράφουν εκείνοι και όχι με αυτήν που φέρει ο ιός της πανδημίας, ενώ το εργαστήριό του χρησιμοποιούσε ένα σύστημα «ψευδοτύπων» (pseudotype system) του είδους που αναφέρουν οι ίδιοι.
Αν το δει κανείς από τη μία πλευρά, το μήνυμα ηλεκτρονικού ταχυδρομείου επιβεβαιώνει τη λογική τους: ότι ένας επιστήμονας, εξετάζοντας το ενδεχόμενο ύπαρξης μιας θέσης τύπου φουρίνης (furin-like site), αναφέρθηκε στο «τυπικό» (βιβλιακό) μοτίβο — το οποίο, ωστόσο, δεν υπάρχει στον SARS-CoV-2.
Αν το δει κανείς από άλλη σκοπιά, το μήνυμα αναδεικνύει κάτι που η εν λόγω ανασκόπηση δεν έθιξε: ήδη από τον Οκτώβριο του 2019, η ιδέα της προσθήκης μιας τέτοιας θέσης διάσπασης από φουρίνη σε μια πρωτεΐνη ακίδα ιών που σχετίζονται με τον SARS, με σκοπό την ενίσχυση της μολυσματικότητας, κυκλοφορούσε όχι μόνο σε μια πρόταση προς τη DARPA, αλλά και εντός ενός εργαστηρίου των NIH.
Τι δημοσιεύτηκε
Όταν οι Κινέζοι επιστήμονες δημοσιοποίησαν τελικά τη γενετική αλληλουχία του νέου κορωνοϊού που εξαπλωνόταν στη Wuhan, στις 10 Ιανουαρίου 2020, ο Letko και ο Munster διέθεταν όλα όσα χρειάζονταν για να τον εξετάσουν στο σύστημά τους.
Η πλατφόρμα δεν απαιτούσε ζωντανό ιό, παρά μόνο την αλληλουχία του μικρού τμήματος της πρωτεΐνης-ακίδας που προσδένεται σε ένα ανθρώπινο κύτταρο. Λίγες ώρες αφότου δημοσιεύτηκε η αλληλουχία, η Neeltje van Doremalen, μια άλλη επιστήμονας στο εργαστήριο του Munster, την έστειλε μέσω email στον Letko και τον Munster.
Ο Letko ανέμενε αποτελέσματα γύρω στις 26 ή 27 Ιανουαρίου. Ωστόσο, προέκυψαν νωρίτερα από το αναμενόμενο.
Στις 21 Ιανουαρίου, ο Munster αποφάσισε πού θα έστελνε το τελικό χειρόγραφο που παρουσίαζε την έρευνά τους. «Θα το στείλουμε στο Nature», έγραψε στον Letko. «Ας το υπογράψουμε ως δύο συγγραφείς, για να επισπεύσουμε τη διαδικασία».
Η εργασία στάλθηκε εκείνο το απόγευμα, τόσο στο περιοδικό Nature όσο και στον διακομιστή προδημοσιεύσεων bioRxiv. Είχαν περάσει μόλις 12 ημέρες από τη στιγμή που η αλληλουχία εμφανίστηκε στο διαδίκτυο.
Το εργαστήριο ανέδειξε την ταχύτητα της νέας μεθόδου ως το κύριο πλεονέκτημά της. Η μέθοδός τους «μειώνει τον χρόνο —από τη δημοσίευση της αλληλουχίας έως την απόκτηση πραγματικών δεδομένων in vitro— σε λιγότερο από 12 ημέρες», ανέφεραν στη συνοδευτική επιστολή προς τους συντάκτες του Nature, «επιτρέποντας στην επιστημονική κοινότητα να αποκτήσει κρίσιμες πληροφορίες σχετικά με τον τροπισμό του ιού [την ικανότητά του να προσβάλλει συγκεκριμένους ιστούς] σχεδόν σε πραγματικό χρόνο, παράλληλα με την εξέλιξη της επιδημίας».
Η εργασία τράβηξε την προσοχή της ηγεσίας του NIAID.
«Τα πρώτα δεδομένα από το εργαστήριό μου επιβεβαιώνουν ότι ο υποδοχέας ACE2 αποτελεί την πύλη εισόδου για τον 2019-nCoV», έγραψε εκείνο το απόγευμα ο Munster σε μια λίστα ηλεκτρονικού ταχυδρομείου του NIAID που αφορούσε την αντιμετώπιση του κορωνοϊού.
Ο Greg Folkers, τότε διευθυντής του γραφείου του διευθυντή του NIAID, Anthony Fauci, απάντησε: «Όταν δημοσιευτεί στο bioRxiv, ίσως αξίζει να γίνει μια ανάρτηση στο Twitter».
Η εργασία που υποβλήθηκε δεν περιέχει καμία ένδειξη ότι ο Letko ακολούθησε την πρόταση του Munster να τροποποιήσει την πρωτεΐνη-ακίδα εισάγοντας σε αυτήν ένα σημείο διάσπασης. Ωστόσο, προκύπτει ότι οι επιστήμονες χρησιμοποίησαν την πρωτεάση θρυψίνη (trypsin), αντί για τη φουρίνη (furin) που είχε προτείνει ο Munster.
Το δεύτερο σχήμα της εργασίας φέρει τον τίτλο: «Η θρυψίνη ενισχύει την είσοδο των ιών της γενεαλογικής γραμμής Β (lineage B) σε διάφορες κυτταρικές σειρές». Αναφέρεται ότι οι πρωτεΐνες-ακίδες κορωνοϊών των νυχτερίδων, οι οποίες δεν μπορούσαν από μόνες τους να εισέλθουν σε κύτταρα ανθρώπων, πρωτευόντων θηλαστικών ή χοίρων, κατάφεραν να εισέλθουν αφού τα σωματίδια εκτέθηκαν στο συγκεκριμένο ένζυμο.
Τα πειράματα με την τρυψίνη δεν εμφανίζονται πουθενά στο πρότζεκτ πριν από την ανταλλαγή απόψεων μεταξύ των Munster και Letko τον Οκτώβριο, η οποία αφορούσε την προδημοσίευση των Menachery και Baric. Επίσης, απουσιάζουν από την περίληψη που είχε κυκλοφορήσει προηγουμένως ο Munster, την άνοιξη.
Η δημοσιευμένη εργασία παραπέμπει στην προδημοσίευση των Menachery και Baric, η οποία αποτέλεσε την αφορμή για τη συζήτησή τους.
Καμία από τις αλληλουχίες που έστειλε ο Anthony τον Μάιο του 2019 δεν περιλαμβάνεται στην εργασία, ενώ δεν γίνεται καμία αναφορά ούτε στον ίδιο ούτε στο πρόγραμμα PREDICT. Το μοναδικό ίχνος του PREDICT στο χειρόγραφο των 18 σελίδων εντοπίζεται σε μια παραπομπή σε υποσημείωση.
Η ομάδα ιών που εξετάστηκε στην εργασία αποτελούνταν από 29 «περιοχές δέσμευσης υποδοχέα» (receptor-binding domains), οι οποίες αντλήθηκαν από μια δημόσια βάση δεδομένων που διαχειρίζεται το NIH (Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας των ΗΠΑ).
Ένας από τους δύο ιούς επανεμφανίστηκε ένα χρόνο αργότερα, όταν το Κέντρο Λοιμώξεων και Ανοσίας (Center for Infection and Immunity) του Πανεπιστημίου Κολούμπια κατέθεσε το πλήρες γονιδίωμά του στη βάση δεδομένων GenBank, στις 6 Ιουλίου 2020, πεντέμισι μήνες μετά τη δημοσίευση της προδημοσίευσης στην οποία θα έπρεπε να είχε συμπεριληφθεί.
Τον Φεβρουάριο του 2021, ο κορωνοϊός νυχτερίδων από την Ουγκάντα και τη Ρουάντα εμφανίστηκε επίσης στο επιστημονικό περιοδικό «Virus Evolution», στο πλαίσιο μιας μελέτης σχετικά με το πώς ιοί συγγενικοί με τον SARS απέκτησαν την ικανότητα να χρησιμοποιούν τον ανθρώπινο υποδοχέα ACE2.
Ο Letko αναφερόταν ως δεύτερος συγγραφέας, το όνομα του Munster βρισκόταν προς το τέλος της λίστας, ενώ ο Anthony ήταν ο κύριος ερευνητής. Στους συν-συγγραφείς περιλαμβάνονταν επίσης οι επιστήμονες πεδίου από την Ουγκάντα και τη Ρουάντα, καθώς και η ηγετική ομάδα του PREDICT, όπως ακριβώς είχε δηλώσει ο Anthony το 2019 ότι θα ήταν απαραίτητο. Όταν εξετάστηκε μέσω της πλατφόρμας του Letko, διαπιστώθηκε ότι ο ιός ήταν αδύνατον να εισέλθει σε ανθρώπινα κύτταρα μέσω του υποδοχέα ACE2.
Ο ιός από τη Μαλαισία —τον οποίο ο Anthony είχε χαρακτηρίσει ως τον πιο ενδιαφέροντα από τους δύο— δεν εμφανίστηκε ποτέ σε δημοσιευμένη μελέτη. Στα αρχεία δεν υπάρχει καμία εξήγηση για τον λόγο. Ο Anthony, ο οποίος είναι πλέον καθηγητής στο Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνιας στο Davis (UC Davis), δεν ανταποκρίθηκε στα αιτήματα για σχολιασμό.
Στις 24 Μαΐου 2021 —δύο χρόνια αφότου είχε αποστείλει μέσω email την αλληλουχία της πρωτεΐνης ακίδας του ιού στο εργαστήριο της Μοντάνα— το Πανεπιστήμιο Κολούμπια κατέθεσε το πλήρες γονιδίωμα του ιού στη GenBank, εκ μέρους της κοινοπραξίας PREDICT, αναγνωρίζοντας τη συμβολή του Τμήματος Άγριας Ζωής της πολιτείας Σαμπάχ (Μαλαισία) και της οργάνωσης EcoHealth Alliance.
